北京時(shí)間10月4日17時(shí)45分許，2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給雅克·杜波切特(Jacques Dubochet), 阿希姆·弗蘭克(Joachim Frank)和理查德·亨德森(Richard Henderson)，表彰他們發(fā)展了冷凍電子顯微鏡技術(shù)，以很高的分辨率確定了溶液里的生物分子的結(jié)構(gòu)。

圖片來(lái)源：諾貝爾官網(wǎng)。

獲獎(jiǎng)人簡(jiǎn)介

約阿基姆·弗蘭克（Joachim Frank）德裔生物物理學(xué)家，現(xiàn)為哥倫比亞大學(xué)教授。他因發(fā)明單粒子冷凍電鏡（cryo-electron microscopy）而聞名，此外他對(duì)細(xì)菌和真核生物的核糖體結(jié)構(gòu)和功能研究做出重要貢獻(xiàn)。弗蘭克 2006 年入選為美國(guó)藝術(shù)與科學(xué)、美國(guó)國(guó)家科學(xué)院兩院院士。2014 年獲得本杰明·富蘭克林生命科學(xué)獎(jiǎng)。

理查德·亨德森（Richard Henderson）蘇格蘭分子生物學(xué)家和生物物理學(xué)家，他是電子顯微鏡領(lǐng)域的開(kāi)創(chuàng)者之一。1975 年，他與 Nigel Unwin 通過(guò)電子顯微鏡研究膜蛋白、細(xì)菌視紫紅質(zhì)，并由此揭示出膜蛋白具有良好的機(jī)構(gòu)，可以發(fā)生α- 螺旋。近年來(lái)，亨德森將注意力集中在單粒子電子顯微鏡上，即用冷凍電鏡確定蛋白質(zhì)的原子分辨率模型。

雅克·迪波什（Jacques Dubochet）， 1942 年生于瑞士，1973 年博士畢業(yè)于日內(nèi)瓦大學(xué)和瑞士巴塞爾大學(xué)，瑞士洛桑大學(xué)生物物理學(xué)榮譽(yù)教授。Dubochet 博士領(lǐng)導(dǎo)的小組開(kāi)發(fā)出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術(shù)制作不形成冰晶體的玻璃態(tài)冰包埋樣品，隨著冷臺(tái)技術(shù)的開(kāi)發(fā)，冷凍電鏡技術(shù)正式推廣開(kāi)來(lái)。

革命性的冷凍電鏡技術(shù)

細(xì)胞里面的生命活動(dòng)井然有序，每一個(gè)部分都有其特定的結(jié)構(gòu)，承擔(dān)不同的功能。生物大分子則是一切生命活動(dòng)的最終執(zhí)行者，它們主要是核酸和蛋白。核酸攜帶了生命體的遺傳信息，而蛋白是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者。自現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生以來(lái)的半個(gè)世紀(jì)里，解析和分析生物大分子的結(jié)構(gòu)、進(jìn)而闡釋其功能機(jī)制一直都是現(xiàn)代生命科學(xué)的核心問(wèn)題之一。

事實(shí)上，一切自然科學(xué)都涉及物質(zhì)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)間的相互作用為核心的研究方向，天文學(xué)研究宇宙、星體等的結(jié)構(gòu)及其相互作用，粒子物理研究物質(zhì)世界的基本粒子的結(jié)構(gòu)和相互作用，甚至包括應(yīng)用性很強(qiáng)的材料科學(xué)都是以研究新型材料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等為核心。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的直接目的是弄清楚生命大分子結(jié)構(gòu)，從而更好地理解生命，理解這個(gè)自然界中“逆熱力學(xué)第二定律”而誕生的奇跡；最終目標(biāo)是公眾通常關(guān)心的實(shí)用價(jià)值。

像數(shù)學(xué)物理公式不會(huì)直接造出飛機(jī)、導(dǎo)彈、計(jì)算機(jī)一樣，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)這樣的基礎(chǔ)研究不會(huì)直接轉(zhuǎn)化為人們生產(chǎn)生活的必須物品。比較具體的應(yīng)用，如藥物設(shè)計(jì)、疫苗開(kāi)發(fā)、醫(yī)療診斷和蛋白質(zhì)分子性能改造（如科學(xué)實(shí)驗(yàn)或工業(yè)生產(chǎn)中酶活性穩(wěn)定性?xún)?yōu)化）等是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究比較容易被大眾所理解的一個(gè)方向，但卻只是其研究?jī)r(jià)值的一個(gè)側(cè)面而已。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如同生命科學(xué)里的數(shù)學(xué)公式和物理定律，甚至在以后會(huì)充當(dāng)生命科學(xué)里面的“化學(xué)元素周期表”，除了幫助發(fā)現(xiàn)或設(shè)計(jì)新藥等，它更重要的價(jià)值是作為最基礎(chǔ)最上游的研究之一，通過(guò)影響一切與其密切相關(guān)的下游科學(xué)和技術(shù)，從而改變我們的世界。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)最早誕生于上個(gè)世紀(jì)中葉，它是一門(mén)通過(guò)研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)來(lái)闡明生命現(xiàn)象的學(xué)科，在其發(fā)展史上有兩個(gè)里程碑式的事件，一個(gè)是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，另一個(gè)肌紅蛋白（Myglobin）晶體結(jié)構(gòu)的解析，這兩個(gè)事件都是上個(gè)世紀(jì)最重要的革命性科學(xué)進(jìn)展，均在劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，并且都于1962年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)（一個(gè)生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，一個(gè)化學(xué)獎(jiǎng)）。同時(shí)它們都是最早使用X射線的方法來(lái)解析生物大分子結(jié)構(gòu)，而這個(gè)方法在過(guò)去半個(gè)世紀(jì)里，一直占據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的統(tǒng)治地位。

在當(dāng)今結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中普遍使用的冷凍電鏡，是上個(gè)世紀(jì)七八十年代開(kāi)始出現(xiàn)、近兩年飛速發(fā)展的革命性技術(shù)，它可以快速、簡(jiǎn)易、高效、高分辨率解析高度復(fù)雜的超大生物分子結(jié)構(gòu)（主要是蛋白質(zhì)和核酸），在很大程度上取代并且大大超越了傳統(tǒng)的X射線晶體學(xué)方法。

冷凍電鏡并不是這兩年才建立的。在蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)誕生大約10多年以后的1968年， 作為里程碑式的電鏡三維重構(gòu)方法，同樣在劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室誕生，Aron Klug教授因此獲得了1982年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。另一些突破性的技術(shù)在上世紀(jì)70年代和80年代中葉誕生，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。這里面的代表科學(xué)家有Ken Taylor, Robert Glaeser和Jacques Dubochet等。

快速冷凍可以使蛋白質(zhì)和所在的水溶液環(huán)境迅速?gòu)娜芤簯B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)，玻璃態(tài)能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保持其天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)，如果以緩慢溫和的方式冷凍，這個(gè)過(guò)程會(huì)形成晶體冰，生物分子的結(jié)構(gòu)將被晶格力徹底損壞。低劑量冷凍成像能夠保存樣品的高分辨率結(jié)構(gòu)信息，確保了從電鏡圖形中解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能性。與此同時(shí)Joachim Frank等則在電鏡圖像處理算法方面奠定和發(fā)展了這項(xiàng)技術(shù)的理論基礎(chǔ)。由此冷凍電鏡的雛形基本建立，總的思路為：

　　1）樣品冷凍（保持蛋白溶液態(tài)結(jié)構(gòu)）；

　　2）冷凍成像（獲取二維投影圖像）；

　　3）三維重構(gòu)（從二維圖像通過(guò)計(jì)算得到三維密度圖）。

該方法為生物大分子結(jié)構(gòu)研究提供了一個(gè)和X射線晶體學(xué)完全不一樣的、全新的思路。但是由于技術(shù)方法的瓶頸，在此后30多年的時(shí)間里只能做一些相對(duì)低分辨率的結(jié)構(gòu)解析工作，在分辨率上一直不能和X射線晶體學(xué)比較，甚至一度被嘲笑為”blob-ology“（英文諷刺語(yǔ)，“一坨輪廓的技術(shù)”）。

但對(duì)于冷凍電鏡來(lái)說(shuō)，技術(shù)難點(diǎn)遠(yuǎn)非單純冷凍。冷凍成像和圖像處理算法一直都是瓶頸。從冷凍電鏡技術(shù)誕生以來(lái)的近30年時(shí)間里，其一直都有進(jìn)展，只是相對(duì)比較緩慢。

最重要的革命性事件大約發(fā)生在兩三年前：一個(gè)是直接電子探測(cè)器的發(fā)明，另一個(gè)是高分辨率圖像處理算法的改進(jìn)。MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的兩位科學(xué)家Richard Henderson和Sjors Scheres在這次革命中起了關(guān)鍵作用（作者注：現(xiàn)代科技革命往往是諸多研究機(jī)構(gòu)若干團(tuán)隊(duì)共同參與，此處僅列舉關(guān)鍵代表，并且僅從技術(shù)角度討論，不涉及生物學(xué)應(yīng)用）。

Richard Henderson是探測(cè)器方面的先驅(qū)，而Sjors Scheres則因他設(shè)計(jì)的Relion程序而名聲大噪，他們由此當(dāng)選為《自然》雜志2014年“十大科學(xué)進(jìn)展年度人物”。兩位科學(xué)家一個(gè)從硬件，一個(gè)從軟件將冷凍電鏡技術(shù)推向了巔峰，將冷凍電鏡技術(shù)的分辨率推向了新高度。（作者注: Henderson教授的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)非探測(cè)器一個(gè)方面，包括冷凍電鏡理論基礎(chǔ)、算法、軟件，重要生物大分子應(yīng)用，如曾首次解析視紫紅質(zhì)跨膜螺旋等等方面；早在20多年前，他就通過(guò)一系列理論分析，預(yù)言了冷凍電鏡研究的尺度、分辨率極限、技術(shù)瓶頸等等，并且斷言：冷凍電鏡將超越其它一切技術(shù)方法，成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的主導(dǎo)工具，如今這些預(yù)言全部應(yīng)驗(yàn)。）

和此前使用的CCD相比，新發(fā)展的直接電子探測(cè)器不僅在電鏡圖形質(zhì)量上有了質(zhì)的飛躍，同時(shí)在速度上大幅提高，還可以以電影的形式快速記錄電鏡圖像。這些特性同時(shí)也伴隨著電鏡圖像處理方面的重大變革，電鏡技術(shù)此前在分辨率上的一個(gè)主要瓶頸是電子束擊打生物樣品造成的圖像漂移和輻射損傷。有了快速電影記錄，我們就可以追蹤圖像漂移軌跡而對(duì)圖像做運(yùn)動(dòng)矯正和輻射損傷矯正，大大提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

盡管如此，電鏡圖像處理一直都是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)，主要的問(wèn)題是冷凍電鏡的圖像噪音極高、信號(hào)極低，而我們的目標(biāo)是從中提取近原子分辨率的結(jié)構(gòu)信息，這就像在一個(gè)機(jī)器轟鳴的工廠里監(jiān)測(cè)一只螞蟻爬行的聲音。冷凍電鏡科學(xué)家就是要完成這項(xiàng)艱巨的任務(wù)，并且真的做到了。有了硬件和軟件方面的雙重提高，冷凍電鏡的分辨率目前已得到了極大的提高，可以和晶體學(xué)相媲美；并且在其它方面已經(jīng)大大超越了晶體學(xué)。

主要體現(xiàn)在下面幾個(gè)方面：

第一，不需要結(jié)晶，研究對(duì)象范圍大大擴(kuò)展，研究速度大大提高。對(duì)于小分子，比方說(shuō)無(wú)機(jī)鹽礦物質(zhì)等自發(fā)就能長(zhǎng)出晶體，小而且穩(wěn)定的蛋白質(zhì)目前來(lái)說(shuō)結(jié)晶并不困難，但是這類(lèi)意義重大的蛋白幾乎都已經(jīng)解析完了，在科學(xué)上沒(méi)有任何重大意義；當(dāng)今時(shí)代，小蛋白已經(jīng)完全不能滿(mǎn)足科學(xué)家們強(qiáng)烈的探索欲望，結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的對(duì)象越來(lái)越大，體系越來(lái)越復(fù)雜，結(jié)晶幾乎成為不可能的事情，即使能結(jié)晶，也不一定衍射，有衍射也不一定能得到原子分辨率結(jié)構(gòu)。

很多年前，許多蛋白質(zhì)晶體科學(xué)家為了完成一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，一個(gè)課題少則5到10年，多則20年，核糖體從上世紀(jì)80年代初首次長(zhǎng)出晶體到2000年左右最終拿到原子分辨率結(jié)構(gòu)整整經(jīng)歷了20年；線粒體呼吸鏈復(fù)合物I從上世紀(jì)90年代初研究，第一次報(bào)道完整晶體結(jié)構(gòu)大約是20年以后。

而冷凍電鏡方法跳過(guò)超大分子復(fù)合物結(jié)晶難的這層技術(shù)屏障，以直接解析復(fù)合物的溶液狀態(tài)的結(jié)構(gòu)為目標(biāo)。

現(xiàn)在利用這項(xiàng)技術(shù)，在MRC-LMB一周時(shí)間就可以解析一個(gè)新的核糖體結(jié)構(gòu)；英國(guó)皇家學(xué)會(huì)主席、MRC-LMB結(jié)構(gòu)中心主任Venki Ramakrishnan 教授，因?yàn)楹颂求w的晶體結(jié)構(gòu)研究而獲得2009年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。他的實(shí)驗(yàn)室在2014年發(fā)表了最后一篇晶體結(jié)構(gòu)文章，此后的文章全部以冷凍電鏡為主。哥倫比亞大學(xué)有一個(gè)非常執(zhí)著的博士后，研究蘭尼堿受體（Ryanodine Receptor）晶體結(jié)構(gòu)長(zhǎng)達(dá)十年之久，最后放棄了晶體，轉(zhuǎn)向了冷凍電鏡技術(shù)，同時(shí)與清華大學(xué)教授顏寧和LMB的Scheres研究組合作，幾個(gè)月就解決了這個(gè)難題，并且達(dá)到近原子分辨率。

第二，樣品需求量小，樣品制備快，可重復(fù)性高。重要生物樣品都是非常珍貴的，總體來(lái)說(shuō)是以微克或者最多以毫克來(lái)計(jì)量，即使得到這點(diǎn)樣品，也要花費(fèi)生物學(xué)家?guī)字?、幾個(gè)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間（大多數(shù)時(shí)候都需要摸索各種條件使樣品處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，以便做進(jìn)一步結(jié)構(gòu)研究）。

蛋白質(zhì)晶體一般要求高濃度大體積，沒(méi)有量變就沒(méi)有質(zhì)變。而同樣量的蛋白可以稀釋以后制備若干冷凍電鏡樣品，每個(gè)樣品有成百上千的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域有幾百個(gè)小孔，每一個(gè)小孔甚至可以收集多張照片。解析一般蛋白的原子結(jié)構(gòu)需要幾萬(wàn)個(gè)顆粒，而對(duì)于高對(duì)稱(chēng)性的樣品幾千個(gè)顆粒就足夠。

第三，可以研究天然的、動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)。X射線晶體學(xué)研究生物大分子結(jié)構(gòu)的一個(gè)主要弱點(diǎn)是無(wú)法拿到天然的動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)檠芯咳藛T無(wú)論如何也無(wú)法繞開(kāi)結(jié)晶這個(gè)過(guò)程。冷凍電鏡就是要做這件事情：直接解析天然的、溶液態(tài)的、動(dòng)態(tài)的（dynamic），甚至原位(in situ)的結(jié)構(gòu)，從而理解生命分子如何在空間和時(shí)間兩個(gè)尺度上以活的動(dòng)態(tài)的方式發(fā)揮功能。

晶體學(xué)只能?chē)L試不同的條件獲得生物大分子某個(gè)或者某些固定的狀態(tài)，而且容易出現(xiàn)晶體堆積引起的不真實(shí)相互作用方式。形象地說(shuō)，冷凍電鏡可以制作完整的高清電影，晶體學(xué)只能從電影里截屏。

第四，技術(shù)革命還將開(kāi)啟巨大的潛在醫(yī)療價(jià)值。冷凍電鏡技術(shù)方法在時(shí)間和精度方面的大幅度提高有時(shí)會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的重大科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。比如，活體病毒結(jié)構(gòu)分析如果可以在分鐘級(jí)別完成，這將有可能轉(zhuǎn)化為潛在的醫(yī)療檢測(cè)手段：從病人體內(nèi)抽取血樣或感染組織細(xì)胞，幾分鐘以后，非常清晰明了地展現(xiàn)病人在細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)層面的異常狀況，甚至給出局部的原子結(jié)構(gòu)圖，從而給出精準(zhǔn)的治療方案。這個(gè)想法現(xiàn)在可能聽(tīng)起來(lái)有點(diǎn)像笑話(huà)，或許再過(guò)若干年人們就不這樣認(rèn)為了。

當(dāng)然冷凍電鏡的革命性不僅僅體現(xiàn)在上述四方面，在此就不一一列舉。有關(guān)冷凍電鏡更加詳細(xì)的介紹，可參見(jiàn)筆者等2010年的中文綜述（《生物物理學(xué)報(bào)》，2010年7月，第26卷，第7期: 533-559）。文章中對(duì)未來(lái)幾年的發(fā)展趨勢(shì)所做的展望，如直接電子探測(cè)器的普及、非對(duì)稱(chēng)性蛋白復(fù)合物近原子分辨率結(jié)構(gòu)解析、冷凍電鏡相關(guān)計(jì)算性能的大規(guī)模提升等等，目前絕大多數(shù)都在過(guò)去的兩三年內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)并飛速發(fā)展。

Frank 師從德國(guó)著名的電子顯微學(xué)家Hoppe博士，Hoppe學(xué)派主張對(duì)任意形狀樣品直接三維重構(gòu)，后來(lái)的電子斷層三維重構(gòu)及cryoEM三維重構(gòu)技術(shù)都與他的早期思想有關(guān)。Frank博士提出基于各個(gè)分散的全同顆粒（蛋白）的二維投影照片，經(jīng)過(guò)分類(lèi)對(duì)位平均，然后三維重構(gòu)獲得蛋白的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)展了一系列算法并編寫(xiě)軟件（SPIDER）實(shí)現(xiàn)無(wú)需結(jié)晶的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析技術(shù)。尤其在核糖體三維重構(gòu)方面有一系列的重要開(kāi)創(chuàng)性工作，可惜當(dāng)年核糖體結(jié)構(gòu)諾貝爾獎(jiǎng)沒(méi)有給他。現(xiàn)在給他在cryoEM單顆粒三維重構(gòu)的一個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)，實(shí)至名歸。